Редактирано от Питър Сарноу, Факултет по медицина на Станфордския университет, Станфордски университет, Калифорния, одобрено на 25 декември 2020 г. (прегледано на 25 октомври 2020 г.)
Докладваме взаимодействието между субединиците в репликацията на коронавируси-транскрипционни комплекси, които са от съществено значение за репликацията и еволюционното запазване.Предоставихме доказателства, че NiRAN домейнът, свързан с nsp12, има нуклеозид монофосфат (NMP) трансферазна активност в транс и идентифицирахме nsp9 (РНК свързващ протеин) като своя цел.NiRAN катализира ковалентното прикрепване на NMP частта към запазения nsp9 амино край в реакция, която разчита на Mn2+ йони и съседни запазени Asn остатъци.Установено е, че активността на NiRAN и NMPилирането на nsp9 са от съществено значение за репликацията на коронавирус.Данните ни позволяват да свържем тази активност на вложения вирусен ензимен маркер с предишните наблюдения в хипотезата, че започването на синтеза на РНК в клас РНК вируси е функционално и еволюционно последователно.
РНК-зависимата РНК полимераза (RdRps) на Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae и 12 други семейства) е свързана с амино-терминалния (N-терминален) домен в неструктурния протеин (nsp), освободен от полипротеина, наречен NiRAN 1ab е съставен от вирусна основна протеаза (Mpro).По-рано беше съобщено за собствената активност на GMPylation/UMPylation на артериалния вирус NiRAN-RdRp nsp и беше предложено да се генерира преходен процес за прехвърляне на нуклеозид монофосфат (NMP) към (понастоящем неизвестен) вирус и/или клетъчна биополимеризация Things.Тук показваме, че коронавирусът (човешки коронавирус [HCoV]-229E и коронавирус 2 на тежък остър респираторен синдром) nsp12 (NiRAN-RdRp) има Mn2+-зависима NMPилираща активност, която се извлича от nsp9 чрез образуването на Mpro-медииран nsp9 след N-краят, фланкиращ nssp, се освобождава протеолитично, фосфорамидатът е свързан към първичния амин (N3825) в N-края на nsp9.Уридин трифосфат е предпочитаният нуклеотид в тази реакция, но аденозин трифосфат, гуанозин трифосфат и цитидин трифосфат също са подходящи ко-субстрати.Изследвания на мутации, използващи рекомбинантни коронавирусни nsp9 и nsp12 протеини и генетично модифицирани HCoV-229E мутанти, определят остатъците, необходими за NiRAN-медиирано nsp9 NMPилиране и репликация на вируса в клетъчна култура.Данните потвърждават предсказанието за остатъци от активното място на NiRAN и определят важната роля на остатъците на nsp9 N3826 в NMPилирането на nsp9 и репликацията на вируса in vitro.Този остатък е част от запазената N-терминална NNE трипептидна последователност и се оказа единственият инвариантен остатък на nsp9 и неговите хомолози в семейството на коронавирусите.Това проучване осигурява солидна основа за функционалното изследване на активността на NMPylation на други вложени вируси и предлага възможни цели за разработването на антивирусни лекарства.
Положително-верижният РНК вирус Nidovirales заразява различни гръбначни и безгръбначни (1, 2).Понастоящем редът включва 14 семейства (3), от които семейството на Коронавирус е проучено задълбочено през последните 20 години.По това време три зоонотични коронавируса се появиха от животински гостоприемници и причиниха мащабни огнища на тежки респираторни инфекции при хората.Включително продължителни пандемии, причинени от тежки остри инфекциозни заболявания.Респираторен синдром Коронавирус 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Нидовирусите споделят обща организация на генома и субединицата на мембранно-свързания репликационно-транскрипционен комплекс (RTC) е кодирана в 5-?²-терминала две трети и основната структурна субединица на вирусната частица, както и някои аксесоари .Протеин, кодиран в 3??² крайната трета на генома (1).С изключение на едно семейство планарни вируси (Monoviridae) (8), всички вложени вируси кодират RTC субединици в две големи отворени рамки за четене (ORF) ORF1a и ORF1b, които се транслират от геномна РНК на.ORF1a кодира полипротеин (pp) 1a, а ORF1a и ORF1b съвместно кодират pp1ab.С общото участие на основната протеаза (Mpro), кодирана от ORF1a, както pp1a, така и pp1ab се обработват протеолитично в различни неструктурни протеини (nsps), известни също като 3CLpro, тъй като има хомоложност с 3Cpro на пикорнавируса ( 9).Смята се, че тези nsps се сглобяват в голям динамичен RTC, катализират синтеза на геномна РНК (репликация) и набор от субгеномна РНК (транскрипция) и се използват за координиране на експресията на ORF, разположена след ORF1b (10?? ?12).
Основният RTC включва РНК-зависима РНК полимераза (RdRp) (13), хеликаза от суперсемейство 1 (HEL1) (14, 15) и няколко ензима за обработка на РНК, които са кодирани главно в ORF1b и в семейството на коронавирус. Той съдържа nsp12-nsp16 и nsp9-nsp12 в семейство Arterioviridae (виж справка 10ââ 12).RdRp и HEL1 представляват два (една пета) запазени домена на вируса на птичите гнезда и имат хомоложност сред другите РНК вируси.Смята се, че основната репликаза се подпомага от други субединици, включително няколко малки nssp, освободени от карбокси-терминалния (С-терминален) регион на pp1a, надолу по веригата на Mpro (съответно коронавирус nsp5 и артериален вирус nsp4).Те имат ограничена специфична за семейството защита и разнообразни дейности (разгледани в справка 10ââ12).
Сравнително наскоро беше намерен домейн с уникални характеристики на мотив на последователност в амино края (N-край) в съседство с RdRp във всички вложени вируси, но не и в други РНК вируси (16).Въз основа на неговото местоположение и нуклеотидна трансферазна активност (нуклеозид монофосфат [NMP] трансфераза) този домейн се нарича NiRAN (свързана с Nestvirus RdRp нуклеотидна трансфераза).Комбинацията с двоен домейн на NiRAN-RdRp съставлява nsp12 в семейство Coronaviridae и nsp9 в семейство Arterioviridae, а в други nestoviridae се очаква NiRAN-RdRp да бъде освободен като независим nsp от вирусния полипротеин.В коронавируса NiRAN домейнът съдържа ??1/450 остатъка и е свързан към С-терминалния RdRp домейн чрез линкерната област (16?19).При вируса на конски артериит (EAV) (Arteriviridae) рекомбинантният nsp9 показва Mn2+ йон-зависими (самостоятелни) активности на UMPилиране и GMPилиране, които зависят от три консервативни бази на последователност в нестовирус, AN, BN и CN Остатъците в последователността.Където N означава NiRAN) (16).N-терминалното фланкиране на тези мотиви е по-малко консервативен мотив preAN.Някои от тези остатъци също са запазени в далечно свързани протеин кинази, където е доказано, че участват в свързването на нуклеозид трифосфат (NTP) и каталитичната активност (20, 21).В съответствие с това наблюдение, няколко ключови остатъка от активни места в псевдокиназата SelO от Pseudomonas syringae могат да бъдат сглобени с наскоро публикувания суперкомплекс SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13.Консервирани остатъци от NiRAN на коронавирус, насложени в електронната микроструктура.Рекомбинантен протеин (17).Спекулира се, че документираното (самостоятелно) U/GMPилиране ще доведе до преходно състояние за прехвърляне на NMP към (понастоящем неизвестен) субстрат (16) и структурното сходство между NiRAN и протеин киназа (17, 19) ) Хипотезата ли е, че NiRAN модифицира други протеини.
Много характеристики, включително неговата уникална и уникална систематична асоциация с вложени вируси и генетично отделяне от RdRp, правят NiRAN разумен ключов регулаторен ензим за вложени вируси, който е от решаващо значение за тяхната поява и идентичност.Преди това бяха извикани три възможни функции, включващи NiRAN за регулиране на геномна/субгеномна транслация или репликация/транскрипция.Като се вземат предвид оскъдните и непълни данни, налични по това време, всяка функция има своите предимства и недостатъци (16).В това изследване ние се стремим да комбинираме биохимичните и обратните генетични изследвания на коронавирусите, представляващи двата рода, и да поставим нашите открития в еволюционния фон на естествената мутация на семейството на коронавирусите, така че да придобием представа за това Мистериозно царство.Отчитаме голям напредък в разбирането на NiRAN чрез идентифициране на естествени мишени в RTC, което (сред трите налични хипотези) допринася за ролята на този домейн в инициирането на синтеза на вложена вирусна РНК.Това изследване също отваря възможности за други роли на NiRAN в интерфейса на хоста на вируса.
За да се характеризират ензимните свойства на свързания с корона вируса nsp12 NiRAN домейн, ние произведохме рекомбинантна форма на човешки коронавирус 229E (HCoV-229E) nsp12 в Е. coli, с His6 маркер в С-края и комбинирахме протеин с [α32-P] Инкубирайте заедно с NTP в присъствието на MnCl2, както е описано в Материали и методи.Анализът на реакционния продукт показва наличието на радиомаркиран протеин, ко-мигриращ с nsp12 (106 kDa), което показва, че nsp12 на коронавирус катализира образуването на ковалентни адукти протеин-NMP, за предпочитане образувани с уридин монофосфат (UMP) (Фигура 1А) и Б).Количественият анализ показа, че в сравнение с други нуклеотиди, интензитетът на сигнала на включването на UMP се увеличава с 2 до 3 пъти (Фигура 1C).Тези данни са в съответствие с прогнозираната NMP трансферазна активност на NiRAN домейна на коронавируса (16), но показват, че нуклеотидните предпочитания на NiRAN домейна на коронавируса и артериалния вирус са различни.
Активност на самоNMPилиране на HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) се инкубира с определения [α-32P] NTP в присъствието на 6 mM MnCl2 за 30 минути (вижте Материали и методи за подробности).Реакционните продукти се разделят чрез SDS-PAGE и се оцветяват с Coomassie brilliant blue.(B) Радиомаркираният протеин се визуализира чрез фосфорно изображение.Позициите на nsp12-His6 и протеиновите маркери за молекулна маса (в килодалтони) са показани в A и B. (C) Интензитетът на радиоактивния сигнал (средно ± SEM) се определя от три независими експеримента.*P≤0,05.Силата на сигнала (процент) е свързана с UTP.
Въпреки че е доказано, че ензимните активности, свързани с NiRAN, са от съществено значение за репликацията на EAV и SARS-CoV в клетъчна култура (16), специфичната функция на NiRAN и потенциалните цели все още не са определени.Наскоро докладваното структурно сходство между NiRAN и семейство протеини с гънки, подобни на протеин киназа (17, 22), ни подтикна да тестваме хипотезата, че NiRAN катализира NMPилирането на други протеини.Ние генерирахме набор от потенциални хомоложни мишени, включително неструктурни протеини, кодирани от HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), всяка от които съдържа С-терминален His6 маркер (SI приложение, Таблица S1), и инкубирайте тези протеини с [α32-P] уридин трифосфат ([α32-P]UTP) в присъствието или отсъствието на nsp12.Говежди серумен албумин и слят протеин MBP-LacZα, произведени в Е. coli, служат като контроли (Фигура 2А, пътеки 1 до 7).Радиомаркираният протеин беше анализиран чрез електрофореза с натриев додецилсулфат-полиакриламиден гел (SDS-PAGE) и авторадиография и беше установено, че има силен радиоактивен сигнал в реакцията, съдържаща nsp12 и nsp9.Позицията на сигнала съответства на молекулната маса на nsp9, което показва nsp12-медиирано UMPилиране на nsp9 (Фигура 2B, пътечка 7).Не бяха открити други тестови протеини, които да бъдат UMPилирани, което ни накара да заключим, че nsp9 е специфичен субстрат на nsp12.В съответствие с данните за самоNMPилиране, показани на фигура 1, nsp12 е в състояние да прехвърли всичките четири NMP към nsp9, въпреки че ефективността е различна, UMP> аденозин монофосфат (AMP)> гуанозин монофосфат (GMP)> цитидин монофосфат (CMP)) ( Картина).3 A и B).При условията, използвани в този анализ (скъсяване на реакцията и времето на експозиция, намаляване на концентрацията на nsp12; материали и методи), самоNMPилирането на nsp12 не може да бъде открито (сравнете Фигура 2B, лента 7 и Фигура 1B), което се оказа ефективен (и множество кръгове) UMP, преместен от nsp12 на nsp9.UMP трансферазната активност изисква присъствието на Mn2+ йони, както е показано на Фигура 3C, докато само минимална UMP трансферазна активност се наблюдава в присъствието на Mg2+ и никаква активност в присъствието на другите два тествани двувалентни катиона.Подобни данни бяха получени в анализи за NMPилиране, съдържащи цитидин трифосфат (CTP), гуанозин трифосфат (GTP) и аденозин трифосфат (ATP) (SI приложение, Фигура S1).
HCoV-229E nsp12-медиирано UMPилиране на nsp9.Серия от протеинови субстрати (включително говежди серумен албумин, MBP-lacZα и серия от HCoV-229E nsps, белязани с C-краен His6, кодиран от ORF1a) бяха използвани за оценка на активността на UMPилиране на HCoV-229E nsp12-His6⁺-медиирана протеин.Инкубирайте протеина с [α-32P] UTP за 10 минути в отсъствие (A) или присъствие (B) на nsp12, както е описано в материалите и методите.В горната част на A и B е показан SDS-полиакриламиден гел, оцветен с Coomassie Brilliant Blue, а в долната част на A и B са показани съответните авторадиограми.Позицията на маркера за молекулна маса на протеина (в килодалтони) е дадена вляво.Позицията на nsp12-His6 (B, отгоре) и радиоактивният сигнал, наблюдаван по време на инкубацията на nsp12-His6 с nsp9-His6 (B, пътека 7), също са посочени, което показва, че [α-32P]UMP към nsp9-His6 (12.9 kDa), което не се наблюдава за други тествани протеини.
HCoV-229E NiRAN-медиирана биохимична и вирусологична характеристика на nsp9 NMPилиране.(A и B) Ролята на нуклеотидния косубстрат, използван в реакцията.Nsp12-His6 и nsp9-His6 се смесват и се инкубират в присъствието на различни [α-32P] NTPs в стандартния тест за NMPилиране.(A, отгоре) Оцветен с кумаси nsp9-His6, разделен чрез SDS-PAGE.(A, отдолу) Авторадиография на същата област на гела.(B) Относителната активност (средно ± SEM) в присъствието на определения нуклеотиден кофактор се определя от три независими експеримента.*P≤0,05.(C) Ролята на металните йони.Показан е стандартният тест за NMPилиране в присъствието на [α-32P] UTP и различни метални йони, всеки с концентрация от 1 mM.В C е показан горният, оцветен с Coomassie nsp9-His6, а в C, долният, е показана съответната авторадиография.Размерът на белязания протеин (в килодалтони) е показан вляво от A и C. (D) Мутантната форма на HCoV-229E nsp12-His6, носеща определеното аминокиселинно заместване, е в [α-32P]UTP, както е описано в Материали и методи.Радиомаркираният nsp9-His6, произведен в реакцията на NMPилиране, се открива чрез изобразяване на фосфорилиране (D, горе).Относителната активност в сравнение с протеина от див тип (wt) е показана в D, а дъното е взето като средна (±SEM) от три независими експеримента.Звездичките показват замествания на незапазени остатъци.(E) Вирусният титър в културалния супернатант на p1 клетки, получен 24 часа след инфекцията, се определя чрез анализ на плака.Посочени са заместванията на кодон в NiRAN домейна на конструирания HCoV-229E мутант (номерирането на остатъците се основава на тяхната позиция в pp1ab).Мутантът на RdRp активния сайт с дефицит на репликация nsp12_DD4823/4AA беше използван като контрола.
За да получим по-задълбочено разбиране на активното място на NiRAN и да определим остатъците, свързани с активността на nsp9-специфичната NMP трансфераза, извършихме мутационен анализ, в който заменихме консервативните остатъци в NiRAN AN, BN и CN мотивите ( 16) Това е Ala (приложение SI, Фигура S2).В допълнение, въздействието на консервативните замествания Arg-към-Lys или Lys-към-Arg беше оценено в два случая.Като (отрицателна) контрола, остатъците, които не са или са по-малко запазени в NiRAN домейна на коронавируси и други вложени вируси, се заменят с Ala. Замяна на K4116A (в мотив preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (мотив BN) и D4280A (CN) значително намалява или дори елиминира NMPилирането на nsp9 чрез nsp12, докато протеините с консервативни замествания (R4178K), K4116R) запазват 60% и 80% от тяхната активност, което показва, че отпускането на ограниченията от съответната им страна вериги е физикохимично чувствителен (Фигура 3D).Замяната на няколко други запазени остатъка E4145A, D4273A, F4281A и D4283A е много по-малко вредна, а UMPилирането на nsp9 е само умерено намалено.Подобни резултати бяха получени в реакции на NMPилиране на nsp9, включващи други NTPs (Фигура 3D и приложение SI, Фигура S3), потвърждавайки, че наблюдаваните ефекти върху специфични аминокиселинни замествания са независими от вида на използвания нуклеотиден ко-субстрат.След това тествахме възможното въздействие на тези nsp12 замествания върху репликацията на коронавирусите в клетъчната култура.За тази цел използвахме подходящи генетично модифицирани комплементарни ДНК (cDNA) шаблони, клонирани в рекомбинантен ваксиниа вирус (23, 24), за да транскрибираме 5-7 клетки.Титруването на инфекциозно вирусно потомство, произведено в тези клетки, показа, че повечето HCoV-229E NiRAN мутанти не са осъществими (Фигура 3E).Група от нежизнеспособни вирусни мутанти включва алтернативи, за които е доказано, че елиминират или значително намаляват NMP трансферазната активност in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), но има две други алтернативи (K4116R, E4145A) 80 % запазени?Тяхната ин витро активност на NMPилиране предполага, че са включени допълнителни ограничения.По подобен начин две други мутации (R4178K, F4281A), които причиняват умерено намаляване на активността на NMPилиране in vitro на NiRAN, произвеждат живи вируси, но тези вируси значително намаляват титрите чрез репликация.В съответствие с данните за активността in vitro, показани на фигура 3D, замяната на четири други остатъка, които не са запазени в коронавирус и/или други вложени вируси (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) произведе жизнеспособни вируси. Потомството, въпреки че има умерено намален титър в сравнение с вируса от див тип (Фигура 3E).
За да се проучи дали NiRAN-медиираната NMP трансферазна активност зависи от активния RdRp домейн, двата запазени Asp остатъка, участващи в координацията на двувалентни метални йони (11) в RdRp мотив C, бяха заменени с Ala. Полученият протеин nsp12_DD4823/4AA запазва неговата nsp9 NMPилираща активност, което показва, че nsp12-медиираната in vitro nsp9 NMPилираща активност не изисква полимеразна активност (SI Приложение, Фигура S4).
След установяване на nsp9-специфичната NMP трансферазна активност за nsp12, ние се опитахме да характеризираме NMP-nsp9 адукта чрез масспектрометрия (MS).Пълният протеинов масов спектър на рекомбинантен HCoV-229E nsp9 показва пик при 12 045 Da (Фигура 4А).Добавянето на nsp12 не променя качеството на nsp9, което показва, че nsp12 и nsp9 няма да образуват стабилен комплекс при използваните условия (денатурация) (Фигура 4А).В присъствието на UTP и GTP измерването на масата на реакцията, съдържаща съответно nsp9 и nsp12, показа, че протеиновата маса на UTP се премества с 306 Da, а протеиновата маса на GTP се премества с 345 Da, което показва, че всяка молекула nsp9 свързва UMP или GMP (Снимка 4) C и D).Спекулира се, че енергията, необходима за NiRAN-медиирано nsp9 NMPилиране, идва от хидролиза на NTP и освобождаване на пирофосфат.Въпреки че в тази реакция е използван 10-кратен моларен излишък на nsp9 (мишена) отколкото nsp12 (ензим), се наблюдава почти пълно NMPилиране на nsp9, което показва, че взаимодействието между nsp12 и nsp9 е краткотрайно и nsp12 може да NMPилира повече nsp9 in vitro молекула.
Единично NMPилиране на nsp9 в присъствието на nsp12 и UTP или GTP.Показан е деконволюционният пълен протеинов масов спектър на HCoV-229E nsp9 (SI приложение, Таблица S1) (AD).(A) nsp9 самостоятелно, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 в присъствието на UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 в присъствието на GTP.
За да се определят UMPилираните nsp9 остатъци от nsp12, nsp9-UMP се разцепва с трипсин.Получените пептиди бяха разделени чрез нано-високо ефективна течна хроматография (HPLC) и анализирани чрез тандемна масова спектрометрия (MS/MS) онлайн.Анализът на данните с помощта на софтуерния пакет Byonic (Protein Metrics) показа UMPилиране на N-терминалната аминокиселина.Това се потвърждава ръчно.Тандемният масов спектър на прекурсорния пептид [UMP]NNEIMPGK (SI приложение, Фигура S5A) разкрива фрагмент при 421 m/z, което показва, че UMP се свързва с остатък 1 на nsp9.
В N-края на nsp9, Asn се запазва сред членовете на Orthocoronavirinae (SI приложение, Фигура S6).Въпреки че вярваме, че азотът на първичния амин от N-края е най-вероятният акцептор за UMP, решихме да получим допълнителни доказателства за свързване на NMP в N-края.Поради тази причина, не-NMPилираният и NMPилираният N-терминален пептид nsp9, пречистен чрез HPLC, се получава в присъствието на ацетон и натриев цианоборохидрид.При тези условия само свободни първични амини могат да бъдат модифицирани с пропил (25).N-терминалният nsp9-производен пептид с последователност NNEIMPGK съдържа два първични амина, единият в N-края на Asn, а другият в страничната верига на Lys в С-края.Следователно, пропилови групи могат да бъдат въведени в двата края.Екстрахираните йонни хроматограми на не-NMPилираните пептиди са показани в приложението SI, Фигура S5B.Както се очаква, N-терминални и С-терминални (моно)пропилирани (SI приложение, Фигура S5B, горна лента) и дипропилирани пептиди (SI приложение, Фигура S5B, долна лента) могат да бъдат идентифицирани.Този модел се променя с използването на NMPилиран N-терминален пептид на nsp9.В този случай могат да бъдат идентифицирани само С-терминални пропилирани пептиди, но N-терминални пропилирани пептиди и дипропилирани пептиди не са идентифицирани (SI Приложение, Фигура S5C), което показва, че UMP е прехвърлен към N-терминалния първичен амин, за да се предотврати това група от извършване на промени.
След това заместваме (с Ala или Ser) или изтриваме запазените остатъци в N-края на nsp9, за да дефинираме специфични за целта ограничения.Въз основа на нашите MS данни, показващи, че NiRAN образува nsp9-NMP адукт с първичния амин на N-крайния остатък на nsp9, ние предположихме, че nsp9 NMPилирането изисква вирусната главна протеаза (Mpro, nsp5), за да освободи nsp9 N-терминала от негов полипротеинов предшественик.За да тестваме тази хипотеза, ние произведохме прекурсорен протеин nsp7-11, съдържащ nsp9 в E. coli и извършихме стандартен тест за NMPилиране в присъствието на [α-32P] UTP (материали и методи).Както е показано на Фигура 5А (лента 3), неразрязаният прекурсор на nsp7-11 не е радиомаркиран с nsp12.Обратно, ако nsp7-11 се разцепи от рекомбинантен nsp5 за освобождаване на nsp9 (и други nssp) от прекурсора, се открива радиомаркиран протеин, който мигрира с nsp9, потвърждавайки нашето заключение, че NiRAN и N-селективното образуване на ковалентни nsp9-NMP адукти .Крайният първичен амин на N-крайния Asn (позиция 3825 в pp1a/pp1ab).Това заключение се подкрепя и от експерименти, използващи конструкцията nsp9, която съдържа един или два допълнителни остатъка в N-края.И в двата случая NiRAN-медиираното UMPилиране на nsp9 беше премахнато (SI приложение, фигура S7).След това произведохме протеин с един или два Asn остатъка, изтрити от пептидната последователност 3825-NNEIMPK-3832 в N-края на nsp9.И в двата случая UMPилирането на nsp9 беше напълно блокирано (Фигура 5B), предоставяйки допълнителни доказателства, че истинският N-край на nsp9 действа като NMP рецептор.
Протеолитичната обработка на nsp9 и ролята на N-терминалните остатъци в nsp12-медиирано UMPилиране.(A) UMPилирането на nsp9 изисква свободен N-терминал на nsp9.Nsp7-11-His6 е предварително инкубиран при 30 °C в буфер за откриване на NMPylation, съдържащ UTP в присъствието или отсъствието на рекомбинантен Mpro (nsp5-His6).След 3 часа започнете анализа за NMPилиране чрез добавяне на nsp12-His6, както е описано в Материали и методи.Реакцията, съдържаща nsp5-His6 (лента 1) и nsp9-His6 (лента 2), се използва като контрола.След 10 минути реакцията се прекратява и реакционната смес се разделя чрез SDS-PAGE.Протеинът се оцветява с Coomassie Brilliant Blue (A, горе).Прекурсорът на Nsp7-11-His6 и обработеният продукт в резултат на медиирано от nsp5-His6 разцепване са показани вдясно.Моля, имайте предвид (поради малкия им размер), че nsp7 и nsp11-His6 не се откриват в този гел и реакцията се допълва с nsp5-His6 (ленти 1 и 4; позицията на nsp5-His6 е обозначена с плътен кръг) или nsp9-His6 (лента 2) съдържа малко количество MBP (означено с празни кръгове) като остатъчни примеси, тъй като те се експресират като MBP слети протеини (SI приложение, таблица S1).(B) На варианта Nsp9-His6 липсват един или два N-терминални Asn остатъка (номериране на остатъците според позицията в pp1a/pp1ab) и се пречиства и инкубира с nsp12-His6 и [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE, оцветен с Coomassie, е показан в горната част, B, съответната авторадиография е показана в долната част.Позицията на маркера за молекулно тегло (в килодалтони) е показана вляво.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-крайни запазени остатъци бяха заменени с Ala или Ser и същото количество протеин беше използвано в реакцията на UMPилиране, медиирана от nsp12-His6.Реакционните продукти се разделят чрез SDS-PAGE и се оцветяват с Coomassie Brilliant Blue (C, отгоре), а радиомаркираният nsp9-His6 се открива чрез фосфоресцентно изобразяване (C, в средата).Използвайки протеин от див тип (wt) като референтен (настроен на 100%), относителната активност на NMPилиране (средно ± SEM) беше изчислена от три независими експеримента.(D) Вирусни титри в супернатантата на p1 клетъчна култура на Huh-7 клетки, заразени с HCoV-229E див тип Huh-7 клетки, и мутанти, носещи определени аминокиселинни замествания в nsp9, бяха определени чрез анализ на плака.Репликационно-дефицитният RdRp мотив C двоен мутант DD4823/4AA беше използван като отрицателна контрола.
N-краят на nsp9 (особено позиции 1, 2, 3 и 6) е много запазен сред членовете на подсемейството Orthocoronavirinae (SI приложение, Фигура S6).За да се проучи възможната роля на тези остатъци в nsp12-медиирано nsp9 NMPилиране, два последователни Asn остатъка в N-края на nsp9 бяха заменени с Ala или Ser (самостоятелно или в комбинация).В сравнение с nsp9 от див тип, заместването на N3825 с Ala или Ser води до повече от двукратно намаляване на медиираното от nsp12 UMPилиране (Фигура 5C).В съответствие с нашето заключение, че NMPилирането се случва при N-терминалния първичен амин вместо страничната верига на N-терминалния остатък, ние наблюдавахме значително остатъчно NMPилиране със замяната на N3825A и N3825S.Интересно е, че ако вторият Asn е заменен с Ala или Ser, nsp9 UMPилирането се намалява по-силно (повече от 10 пъти), докато заместването на Ala на позиции 3, 4 и 6 има само умерен ефект върху nsp9 UMPилирането (Фигура 2 ) .5C).Подобни резултати са получени при използване на ATP, CTP или GTP (приложение SI, Фигура S8).Взети заедно, тези данни показват ключовата роля на N2826 (позиция 2 в nsp9) в nsp9 NMPylation.
За да получим допълнителни доказателства за функционалната корелация между N-края на nsp9 и NMPилирането, ние извършихме подравняване на множество последователности (MSA) на последователността nsp9 от семейството на коронавирус (варираща между 104 и 113 остатъка) (SI приложение, фигура S6).Общо при 47 (познати и предполагаеми) вида от 5 рода на подсемейство Orthocoronavirinae, които заразяват различни бозайници, птици и влечуги гостоприемници, само общо 8 остатъка са открити като инвариантни.Най-мащабните промени, включително делеции и вмъквания, се наблюдават в циклите между вторичните структурни елементи на nsp9, както е определено от предишни структурни изследвания (26-28).Пет инвариантни остатъка бяха открити в β веригата и α спиралата на С-терминалната част на nsp9.Три инвариантни остатъка съставляват NNE мотива на N края на nsp9.Разкрито е, че вторият Asn на този мотив е единственият инвариантен остатък, който също се споделя от хипотетичния nsp9 на далечно свързания коронавирус на жаба и представлява вида Microhyla letovirus 1 в подсемейството Letovirinae на Alphaletovirus.Запазването на остатъците в елементите на вторичната структура на nsp9 може да се рационализира чрез структурни съображения, за да се поддържа сгъването или известните свойства на свързване на РНК.Въпреки това, това разсъждение изглежда не се отнася за запазването на NNE и преди това изследване естеството на ограниченията, които ограничават вариацията на трипептидната последователност, беше напълно затъмнено.
За да се определи значението на nsp9-NMPилирането и запазването на NNE при репликацията на коронавирус, ние произведохме HCoV-229E мутанти, които носят единични или двойни замествания на nsp9 N-терминални остатъци, което показва, че nsp9 NMPилирането е вредно in vitro.Преди да започнем, ние се опитваме да отговорим на въпроса дали тези замествания (близо до мястото на разцепване на nsp8|9) влияят на протеолитичната обработка на С-терминалния pp1a регион.Набор от nsp7-11 полипротеинови конструкции, съдържащи съответните замествания в N-края на nsp9, бяха произведени в Е. coli и нарязани с рекомбинантен Mpro.Протеолитичното разцепване на четирите места (включително страничното място на nsp9) не се повлиява значително от никакви въведени замествания (SI приложение, Фигура S9), с изключение на структурни промени в тези протеини, които пречат на Mpro-медиираното nsp8|9 разцепване (Или друго) уебсайт.
Клетките Huh-7 бяха трансфектирани с HCoV-229E РНК с дължина на генома, кодираща Ala или Ser замествания в запазените NNE трипептиди (N3825, N3826 и E3827) в края на nsp9 N, което показва, че повечето от мутациите са фатални.Успяхме да спасим вируса чрез замяна на Ser или Ala на N-крайния Asn (N2835A или N2835S), но не успяхме да възстановим вируса с други единични и двойни мутации в NNE последователността (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Фигура 5D).
Тези резултати показват, че репликацията на коронавируси в тъканна култура е ограничена (еднаква или подобна), ограничавайки естествената мутация на местата за NMPилиране на nsp9 в тялото и подкрепяйки ключовата роля на този отговор в жизнения цикъл на коронавирусите.
В последния набор от експерименти произведохме С-краен His6, белязан с SARS-CoV-2 nsp12 и nsp9, и две мутантни форми на nsp12 в E. coli.Остатъците от активния сайт в домейните NiRAN и RdRp бяха съответно Използвайте Ala вместо това (Фигура 6A и приложение SI, Таблица S2).K4465 в SARS-CoV-2 nsp12 съответства на K4135 в HCoV-229E (Приложение SI, Фигура S2), което се оказа необходимо за активността на NiRAN и репликацията на HCoV-229E (Фигура 3D и E).Този остатък също съответства на остатъка на артериалния вирус EAV nsp9 K94, за който преди това беше показано, че е необходим за NiRAN самоUMPилиране/само-GMPилиране (16).Както е показано на фигура 6B, SARS-CoV-2 nsp12 има UMP трансферазна активност, използвайки nsp9 като субстрат, докато мутантът на активното място на nsp12_K4465A е неактивен.Двойното заместване в SDD характерната последователност на RdRp мотив C не засяга UMP трансферазната активност (Фигура 6B), което показва, че RdRp активността няма директен ефект при nsp9 UMPилиране.Подобни данни бяха получени с помощта на CTP, GTP и ATP (приложение SI, Фигура S10).В обобщение, тези данни показват, че медиираното от NiRAN nsp9 NMPилиране има консервативна активност в коронавируси, представляващи различни родове от подсемейството на ортокоронавирусите.
SARS-CoV-2 nsp12-медиирано NMPилиране на nsp9.(A) Оцветен с Coomassie SDS-полиакриламиден гел, показващ рекомбинантния протеин, използван в теста за NMPилиране.Като контрола беше използван мутантен протеин със заместване на активното място в NiRAN домейна (K4465A) и RdRp домейна (DD5152/3AA) на SARS-CoV-2 nsp12.Номерирането на остатъците се основава на позицията в pp1ab.(B) Авторадиография на откриване на UMPylation, използвайки nsp9-His6 и [α-32P]UTP като субстрат на nsp12-His6 (див тип [wt] и мутант).Молекулната маса (в килодалтони) на белязания протеин е показана вляво.
NiRAN домейните обикновено са запазени в Nidovirales (16), което показва, че те катализират ензимни реакции, които са от съществено значение за репликацията на Nidovirus.В това проучване успяхме да докажем, че домейнът NiRAN на коронавируса прехвърля NMP (генериран от NTP) към nsp9, мистериозен РНК свързващ протеин, участващ в репликацията на вируса (26 ?? 29), за да го определим като естествена цел и партньор на коронавирус RTC.
Домейнът NiRAN споделя три мотива на последователност (AN, BN и CN), които съдържат много малък брой остатъци, които са запазени във всички семейства в монофилетичния, но силно диференциран ред Nidovirales (8, 16) .Последните проучвания показват, че те са структурно свързани с до голяма степен нехарактеризирано семейство протеини, подобни на протеин киназа, които първоначално са били наречени семейство SelO (17, 19, 22, 30, 31).SelO-свързаните протеини имат киназни гънки, но им липсват няколко запазени активни остатъци в класическите кинази (22, 32).Въз основа на обратната ориентация на ATP молекулите, свързани с активното място и стабилизирани чрез специфични взаимодействия, SelO беше хипотезиран и впоследствие потвърден, че пренася AMP (вместо фосфат) към протеиновия субстрат (22), докато друг бактериален SelO-подобен протеин YdiU има наскоро беше показано, че катализира ковалентното прикрепване на UMP към Tyr и His остатъците на различни протеинови субстрати (33).
За да потвърдим и разширим прогнозата за предполагаемите остатъци от активното място на коронавирусния NiRAN домейн, използвахме биохимични и обратни генетични методи, за да извършим мутационен анализ на коронавируса nsp12 (Фигура 3D и E и SI приложение, Фигура S3 и таблица) S1â S4).Данните показват, че заместването на HCoV-229E K4135, R4178 и D4280 с Ala елиминира in vitro NMP трансферазната активност и репликацията на вируса в клетъчната култура (Фигура 3D и E и SI приложения, Фигура S3), подкрепяйки тяхното присъствие в NTP γ-фосфат (K4135, R4178) и координацията на металните йони на активното място (D4280).Показано е, че E4145A заместването на консервирания Glu в обхвата на вируса на птичи гнезда, за който се очаква да стабилизира позицията на K4135 (17), елиминира вирусната репликация, но изненадващо, активността се запазва в in vitro анализа на NMPилиране (Фигура 3D и E и SI приложение, фигура S3 и таблици S1–S4).Подобно наблюдение беше направено, когато съответното заместване беше въведено в YdiU хомолога на Salmonella typhimurium (E130A) (33).Взети заедно, тези данни подкрепят регулаторната функция на този запазен остатък, а не каталитичната функция.
Замяната на консервирания Phe остатък (F4281A) в рамките на обхвата на нестовирус в домейна HCoV-229E NiRAN (8) доведе до намаляване на активността на NMPилиране in vitro и значително намаляване на репликацията на вируса в клетъчната култура (Фигура 3D, E и SI) приложение, Фигура S3).Данните са в съответствие с важната регулаторна функция на този остатък, като хомоложния DFG мотив Phe остатък, показан по-рано.В класическите протеин кинази той е част от веригата за свързване на Mg2+ и помага за сглобяването и регулирането на гръбначния стълб???Необходим за ефективна каталитична активност (32, 34).Заместването на Ala и Arg за K4116 остатъци (в preAN мотива), съответно, елиминира вирусната репликация и, както се очаква, има различни ефекти върху NMP трансферазната активност in vitro, в зависимост от въведената странична верига на аминокиселината (Фигура 3D и E и SI приложения , фигура S3).Функционалните данни са в съответствие със структурната информация, което показва, че този остатък е установил взаимодействие с ATP фосфат (17).В NiRAN домейна на други вложени вирусни семейства, позицията на HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 е заета от Lys, Arg или His (8), което показва, че функционалното ограничение на този специфичен остатък е отслабено.Заместването на D4188A и D4283A елиминира или силно намалява ензимната активност и елиминира вирусната репликация (Фигура 3).Тези два остатъка са запазени в повечето (но не всички) вложени вируси (8), което показва важна специфична за семейството, но вероятно некаталитична функция.Ala замествания на няколко други Lys и Asp остатъци (K4113A, D4180A, D4197A и D4273A), които не са запазени в Coronaviridae или други семейства Nestioviridae (8), бяха използвани като контроли.Както се очаква, тези замествания са до голяма степен поносими, с леко намаляване на ензимната активност и вирусната репликация в някои случаи (Фигура 3 и SI приложение, Фигура S3).Като цяло, данните за коронавирусна мутагенеза са много в съответствие с данните за GMP и обратната генетика на EAV NiRAN-RdRp (16), в които EAV nsp9 (коронавирус nsp12 ортолог) остатък K94 (съответстващ на HCoV- 229E K4135) важни функции), R124 (съответстващ на R4178), D132 (съответстващ на D4188), D165 (съответстващ на D4280), F166 (съответстващ на F4281).В допълнение, данните за мутагенезата на HCoV-229E са в съответствие и са разширени от докладваните по-рано данни за обратна генетика на SARS-CoV (16), също толкова подобни на тези, наблюдавани за съответния CN мотив Phe-to-Ala мутант SARS-CoV_nsp12 описан фенотип -F219A и HCoV-229E_F4281A (Фигура 3 D и E и SI приложение, Фигура S3 и Таблица S1-S4).
В сравнение с EAV ортолозите (16), които имат ясно предпочитание към UTP и GTP (в реакцията на самоNMPилиране), нашето проучване показва, че коронавирусният домейн NiRAN (представен от HCoV-229E и SARS-CoV-2) може да бъде ефективно прехвърлени всичките четири NMP, въпреки че има леко предпочитание към UMP (фигури 1 и 3).Относително ниската специфичност на специфичния NTP ко-субстрат е в съответствие с наскоро докладваната SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 суперкомпозитна структура, в която ADP-Mg2+ се свързва с активното място на NiRAN, но не и с аденинова част на формирането на специфични взаимодействия (17).В нашето изследване типът нуклеотид, използван в реакцията на NMPилиране, няма различен ефект върху активността на мутантния протеин (SI Приложение, Фигура S3), което показва, че нито един от тези остатъци не е тясно свързан със свързването на специфична нуклеобаза.Структурната основа и потенциалното биологично значение на различните NTP ко-субстратни предпочитания, наблюдавани в NiRAN домейните на коронавирусите и артериалните вируси, остават да бъдат проучени;те може да са верни или да се дължат на ограниченията на съответните им проучвания.Понастоящем не може да се изключи, че потенциалната NMPylator активност на NiRAN домейна на артериалния вирус (в сравнение с предварително характеризираната активност на самоNMPилиране) има различно ко-субстратно предпочитание, като се има предвид, че сходството между артериалния и коронавирусния Домейнът NiRAN е на лимита си.Сравнение на базата на последователност (16).В сравнение с псевдокиназата SelO, която използва Mg2+ като кофактор, активността на коронавируса и артериалния вирус NiRAN зависи от Mn2+ (16) (Фигура 3C и приложение SI, Фигура S1).Зависимостта от Mn2+ и очевидното предпочитание към UTP е необичайна характеристика на протеиновите NMPylators и едва наскоро беше потвърдено в YdiU протеина на Salmonella typhimurium, който катализира стриктното Mn2+-зависимо протеиново UMPилиране на шаперон за защита на клетките от индуциране на стрес Клетъчен ATP пул ( 33).
Наскоро описаното структурно сходство между коронавирусния NiRAN домейн и клетъчните протеин кинази (17, 19) осигурява допълнителна подкрепа за способността на NiRAN да свързва ковалентно NMP с други протеини, които докладвахме в това проучване.Фокусирахме нашето търсене на възможни NiRAN цели върху протеините, кодирани от HCoV-229E ORF1a, за които е известно, че пряко или косвено подпомагат ORF1b-кодираната репликаза на RTC (12, 35).Нашите експерименти предоставят убедителни доказателства за ефективното и специфично NMPилиране на nsp9 (Фигура 2).Ако целевият протеин се използва в моларен излишък, който е 8 до 10 пъти по-висок от този на ензима (nsp12), се потвърждава, че nsp9 е напълно (моно)NMPизиран (Фигура 4).Заключихме, че взаимодействието между nsp12 и nsp9 е краткотрайно и няма да образува стабилен комплекс с nsp9 (при липса на други RTC субединици).Това заключение се подкрепя от проучвания за протеинови взаимодействия върху протеома на SARS-CoV (35).MS анализът идентифицира първичния амин на N-терминалния остатък на nsp9 като място за NMPилиране (SI приложение, Фигура S5).Образуването на фосфорамидатната връзка и N-терминалната аминогрупа разграничава NiRAN-медиираната активност на NMPилиране от Pseudomonas syringae SelO-медиирана реакция на AMPилиране, която катализира образуването на О-свързан AMP при Ser, Thr или Tyr остатъци Пептиден адукт ( 22), а S. typhimurium YdiU образува О-свързани (с Tyr) и N-свързани (с His) пептид-UMP адукти.Ограничената налична информация за SelO семейството протеини показва, че членовете на това голямо протеиново семейство се различават значително в образуването на пептид-NMP адукти.Това е интересно наблюдение, което заслужава допълнително проучване.
Данните, получени в това проучване, ни накараха да предположим, че NMPилирането на nsp9 изисква свободен N-край.В контекста на вирусната репликация, това ще бъде осигурено от протеолитичното разцепване на мястото за обработка на nsp8|nsp9 в репликазния полипротеин pp1a, медииран от Mpro и pp1ab.При повечето коронавируси разликата между това специфично място (VKLQ|NNEI в HCoV-229E) и всички други места на разцепване на коронавирус Mpro е, че Asn (а не друг малък остатък, като Ala, Ser или Gly) заема P1â???Местоположение (36).Данните за пептидно разцепване, получени в ранните проучвания, показват, че ефективността на разцепване на мястото на nsp8|nsp9 е по-ниска от тази на други места, което показва, че 1) това специфично място може да има регулаторна роля в навременната координирана обработка на С-терминала pp1a област, или 2) a Ролята на специалния запазен N-край на nsp9 в репликацията на вируса (37).Нашите данни (Фигура 5А) показват, че рекомбинантната форма на nsp9, носеща истинската N-терминална последователност, е била ефективно NMPизирана от nsp12.N-терминалната фланкираща последователност беше отстранена чрез фактор Xa (nsp9-His6; SI приложение, Таблица S1) или Mpro-медиирано разцепване (nsp7-11-His6; Фигура 5A и SI приложение, Таблица S1).Важно е, че неразрязаният nsp9-съдържащ прекурсор nsp7-11-His6 показа резистентност към NMPилиране на nsp12, което е в съответствие с нашите данни, което показва, че nsp9-NMP адуктът се образува чрез N-терминалния първичен амин (SI приложение, Фигура S5) .За да придобием по-задълбочено разбиране на специфичността на субстрата на NiRAN, след това се фокусирахме върху съседните N-терминални остатъци на nsp9.В отсъствието на други протеини, те са структурно гъвкави, предотвратявайки откриването им в небелязаната форма на nsp9 (26, 28, 38), което показва тяхната ограничена естествена вариация. Това се дължи на важната специфична за последователността (не свързана с вторична структура) функция на nsp9 N-крайния фрагмент.Ala замествания на запазени остатъци в този регион (Фигури 5C и D и SI приложение, Фигура S8) разкриват, че N3826 е от съществено значение за nsp9 NMPилиране in vitro, докато N3825A и E3827A замествания водят до намаляване на NMPилирането, докато M3829A и P3830A замествания не .Очевидно засяга nsp9 NMPylation.Въпреки че заместването на N-крайния Asn (N3825A, N3825S) има само умерен ефект върху NMPилирането на nsp9 и репликацията на вируса в клетъчна култура (Фигура 5C и D), делецията на последователност на Asn остатък от N-терминалния 3825-NN дипептид се оказа, че е смъртоносен за вирусите, което показва, че е необходим един Asn остатък преди друг остатък в N-края, за предпочитане Asn, въпреки че изглежда, че заместването на подобни остатъци може да бъде частично толерирано (Фигура 5B, C и D).Ние заключаваме, че дипептидът 3825-NN, особено запазеният и основен N3826 остатък в обхвата на коронавируса (SI приложение, Фигура S6), осигурява правилното свързване и ориентация на nsp9 N-края в активното място на NiRAN.
Заместването на Ala (E3827A) за запазения Glu от всички подсемейства запазва nsp9 NMPилирането in vitro, но е смъртоносно за вирусите в клетъчната култура (Фигура 5C и D), което показва допълнителната функция на този остатък, например, в ключови взаимодействия (NMPилиран или немодифициран ) nsp9 N-край и други фактори, участващи в репликацията на вируса.Мутациите на Nsp9 не повлияват протеолитичния процес на nsp9 или който и да е съседен nsps (39) (SI Приложение, Фигура S9), което показва, че леталните фенотипове на няколко наблюдавани мутации на nsp9 не са причинени от дисрегулация на C протеолитичния процес-терминална pp1a област .
Горните данни предоставят доказателство, че след Mpro-медиирано третиране на мястото на разцепване на nsp8|9 в pp1a/pp1ab, N-краят на nsp9 може да бъде UMPилиран (или частично модифициран с друг NMP).В допълнение, отличното запазване на N-края на nsp9 (включително единичните и инвариантни Asn остатъци в коронавирусната фамилия) и обратните генетични данни, получени в това проучване (фигури 3E и 5D), ни накараха да заключим, че описаното NMPилиране на nsp9 е биологично свързан и от съществено значение за репликацията на коронавирус.Функционалните последствия от тази модификация остават да бъдат проучени, например по отношение на описаната по-рано (неспецифична) nsp9 (немодифицирана форма) РНК свързваща активност (2628).N-терминалното NMPилиране може също да повлияе на взаимодействието на nsp9 с протеинови или РНК субстрати или образуването на различни сглобки на четири нива.Те са наблюдавани в структурни проучвания и е потвърдено, че са функционално свързани с репликацията на коронавирус, въпреки че особено в отсъствието на В случая на тази модификация (26-ââ29, 40).
Въпреки че целевата специфичност на коронавирусния NiRAN домейн все още трябва да бъде характеризирана по-подробно, нашите данни показват, че протеиновата целева специфичност на коронавирусния NiRAN домейн е много тясна.Въпреки че запазването на ключови остатъци от активни сайтове (8, 16) в NiRAN домейна на всички нидовирусни семейства силно подкрепя активността на консервирания NMPylator тези протеини, идентичността на субстратно свързващите джобни остатъци на този домейн Консервация и консервация остава да се характеризира , и може да се различава между различните семейства на Nidovirales цели.По същия начин съответните цели на други вложени вируси все още не са определени.Те могат да бъдат отдалечени ортолози на nsp9 или други протеини, тъй като последователностите извън петте репликазни домена, които обикновено се запазват в вложените вируси, са по-малко запазени (8), включително геномния масив между Mpro и NiRAN. Сред тях nsp9 се намира в коронавирус.
Освен това в момента не можем да изключим възможността NiRAN домейнът да има допълнителни (включително клетъчни) цели.В този случай си струва да се спомене, че бактериалните хомолози в този нововъзникващ протеин NMPylators (NMPylators) (30, 31) изглежда имат „главни регулатори“?NMP модулира различни клетъчни протеини, за да регулира или елиминира техните дейности надолу по веригата, като по този начин играе роля в различни биологични процеси, като реакция на клетъчен стрес и редокс хомеостаза (22, 33).
В това проучване (Фигури 2 и 4 и Приложение SI, Фигури S3 и S5), ние успяхме да докажем, че nsp12 прехвърля UMP (NMP) частта в една единствена (запазена) позиция в nsp9, докато други протеини не са модифицирани в използвани При условията се поддържа добре дефинирана (а не свободна) специфичност на субстрата.В съответствие с това, в сравнение с N-крайното NMPилиране на nsp9, собствената активност на NMPилиране на nsp12 е много ниска, откриването му изисква по-дълго време на експозиция на авторадиография и се използва 10-кратно увеличение на концентрацията на nsp12.В допълнение, нашият MS анализ не успя да предостави доказателства за NMPилиране на nsp12, което предполага, че самоNMPилирането на NiRAN домейн е (в най-добрия случай) вторична дейност.Въпреки това, трябва да се отбележи, че други проучвания са предоставили предварителни доказателства, че статусът на самоАМПилиране на бактериален NMPylator може да контролира тяхната активност на NMPylation върху други протеинови субстрати (22, 33).Следователно са необходими повече изследвания за изследване на възможните функционални ефекти от дейностите по самоNMPилиране, докладвани за EAV nsp9 (16) и коронавирус nsp12 (това проучване), включително предложения подобен на шаперон ефект върху сгъването на С-терминалния RdRp домейн ( 16) ).
По-рано са били разглеждани няколко хипотези относно възможните функции надолу по веригата на нидовирусния NiRAN домейн, включително РНК лигаза, РНК-затворена гуанилат трансфераза и праймираща активност на протеин (16), но нито една от тях не е съвместима с наличните функции надолу по веригата.Информацията, получена в следните позиции, е точно същото време, без да се правят допълнителни предположения.Данните, получени в това проучване, са в най-голямо съответствие с (но не могат да докажат), че NiRAN домейнът участва в инициирането на протеин-индуцирана РНК синтеза.По-рано се смяташе, че функцията на домейна NiRAN в 5??²-РНК затваряне или реакции на лигиране на РНК не се влияят от тези и подкрепата на други данни.Следователно, например, се счита, че активното място на NiRAN включва запазения Asp като обща база (D252 в Pseudomonas syringae SelO; D4271 в HCoV-229E pp1ab; D208 в SARS-CoV-2 nsp12) (SI Приложение, фигура 2 ).S2) (17, 22, 33), докато катализата в АТФ-зависимата РНК лигаза и РНК затварящия ензим се извършва от ковалентния ензим-(лизил-N)-NMP междинен продукт, който включва непроменен Lys остатък ( 41).В допълнение, забележителната базирана на последователност специфичност на коронавируса NiRAN за запазени протеинови мишени и отпуснатата специфичност за NTP ко-субстрати (предпочита UTP) се противопоставят на NiRAN-медиираните затварящи ензими или подобни на РНК лигаза функции.
Очевидно е необходима много допълнителна работа, за да се провери и, ако се докаже, да се разработи по-подробно възможната роля на nsp9-UMP (nsp9-NMP) в протеин-индуцирания синтез на РНК, което ще свърже няколко интересни, но (засега) доклада, докладвани по-рано .Изолирани наблюдения.Например, установено е, че краят на РНК с отрицателна верига на коронавируса започва с олиго(U) верига (42, 43).Това наблюдение е в съответствие с идеята, че синтезът на РНК с отрицателна верига се инициира чрез свързване на UMPилираната форма на nsp9 към поли(А) опашката (тригери), което може да бъде насърчавано от нейното РНК свързване Активността и/или взаимодействието с друг RTC протеин.UMP частта, осигурена от nsp9, може след това да се използва като "праймер" за медиирано от nsp7/8/nsp12 олигоуридилиране, използвайки 3??²-poly(A) опашката в геномната РНК или друга олиго (A)-съдържаща последователност служи като шаблон, подобно на механизма, установен за пикорнавирусния VPg протеин (44).А ако предложението е „ненормативно“????Започването на (протеин-индуцирания) синтез на РНК с отрицателна верига осигурява връзка с наблюденията, показвайки, че РНК с отрицателна верига на коронавируса има UMP (вместо UTP) в своя край (42), което се счита, че показва, че нуклеиновата киселина Dicer разцепва края, фосфорилиран от неизвестна уридин-специфична ендонуклеаза.Ако се потвърди, тази хидролитична активност на нуклеинова киселина може да помогне за освобождаването на олигомерната UMPилирана форма на nsp9 от 5² края на зараждащата се отрицателна верига.Възможната роля на nsp9 в праймирането на протеини също е в съответствие с предишни обратни генетични изследвания, които показват, че nsp9 (и nsp8) взаимодействат критично и специфично със запазения цис-действащ РНК елемент близо до 3 края на генома на коронавируса.45).Според този доклад тези предишни наблюдения могат да бъдат преразгледани и разширени чрез по-нататъшни изследвания.
В обобщение, нашите данни определят специфичната активност на патентован вложен вирусен ензимен етикет, свързан с RdRp в N-края.При коронавирус тази новооткрита NiRAN-медиирана активност на UMPylator/NMPylator се използва, за да разчита на Mn2+ и съседни Asn остатъци и да причини образуването на (нискоенергийни) фосфорамидатни връзки с N-терминалния първичен амин.Чрез Mpro-медиирано разцепване в мястото на разцепване на nsp8|9, целта на nsp9 може да се използва за NMPилиране, което показва функционалното свързване между протеазата и NiRAN домейна, който се простира до RdRp.Запазването на ключови остатъци в активното място на nsp12 NiRAN и целта на nsp9, съчетано с данни, получени от два коронавируса, включително SARS-CoV-2, предоставя убедително доказателство, че nsp9 NMPylation е коронавирус. Консервативните характеристики също са ключова стъпка в репликацията на вируса.Наличните данни ни карат да заключим, че специфичната роля на NMPилираната форма на nsp9 в протеин-индуцирания синтез на РНК е разумен сценарий за коронавирус и други вложени вируси и NiRAN може също да се насочи към други неидентифицирани протеини.Регулирайте вируса.Взаимодействие с домакина.Ако бъде потвърдено, участието на протеинови праймери в синтеза на вирусна РНК ще повиши афинитета на последователността на домейните Mpro/3CLpro и RdRp между открития по-рано коронавирус и пикорнавирус-подобна супергрупа (9), които сега са обединени в наскоро създадените Pisonivirites ( 46) в категорията.
Нашите данни показват също, че основните, селективни и консервативни ензимни активности, идентифицирани в това проучване, могат да се използват като мишени за антивирусни лекарства.Съединения, които пречат на свързването (и последващата модификация) на запазения N-край на nsp9 в активното място на NiRAN, могат да бъдат разработени в ефективни и многостранни антивирусни лекарства, подходящи за лечение на животински и човешки коронавируси от различни (под)родови инфекции , включително SARS-CoV-2 и близкоизточния респираторен синдром на коронавируса.
Кодиращата последователност на коронавирусния протеин, произведен в това проучване, беше амплифицирана чрез RT-PCR с помощта на РНК, изолирана от Huh-7, заразен с HCoV-229E или Vero E6, заразен със SARS-CoV-2, и вмъкната чрез стандартни процедури за клониране.pMAL-c2 (Биологична лаборатория на Нова Англия) или pASK3-Ub-CHis6 (47) експресионен вектор (SI Приложение, Таблици S1 и S2).Заместванията на единичен кодон са въведени чрез PCR-базирана сайт-насочена мутагенеза (48).За да се произведе MBP слят протеин, E. coli TB1 клетките се трансформират с подходящата pMAL-c2 плазмидна конструкция (SI приложение, Таблица S1).Слетият протеин се пречиства чрез амилозна афинитетна хроматография и се разцепва с фактор Ха.Впоследствие С-терминалният His6-белязан протеин се пречиства чрез Ni-имобилизирана метална афинитетна хроматография (Ni-IMAC), както е описано по-горе (49).За да произведат слетия протеин на убиквитин, клетките E. coli TB1 използват подходящата pASK3-Ub-CHis6 плазмидна конструкция (SI Приложение, Таблици S1 и S2) и pCGI плазмидна ДНК, кодираща убиквитин-специфична С-терминална хидролаза 1 (Ubp1).Трансформация (47).С-терминалният His6-белязан коронавирусен протеин беше пречистен, както е описано по-горе (50).
Тестът за самоNMPилиране на HCoV-229E nsp12-His6 беше извършен, както е описано в EAV nsp9 (16).Накратко, nsp12-His6 (0,5 µM) съдържа 50 mM 4-(2-хидроксиетил)-1-пиперазинетансулфонова киселина (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM дитиотреитол (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM буфер, инкубирайте посоченият NTP и 0,17 µM съвпадат с [α32-P]NTP (3000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) при 30 °C за 30 минути.Във всички други (стандартни) анализи на NMPилиране на nsp12-медиирано nsp9 NMPилиране, реакционните условия се коригират, както следва: nsp12-His6 (0,05 µM) и nsp9-His6 (4 µM) в присъствието на 50 mM HEPES-KOH (рН 8,0 ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM указан NTP и 0,17 µM съответстващ [α32-P]NTP.След инкубиране в продължение на 10 минути при 30°C, реакционната проба се смесва с SDS-PAGE буфер за проба: 62,5 mM трис(хидроксиметил)аминометан HCI (рН 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% глицерол и 0,005% бромофенол син.Протеинът се денатурира чрез нагряване при 90 °С в продължение на 5 минути и се разделя с 12% SDS-PAGE.Гелът се фиксира и оцветява с разтвор на Coomassie Brilliant Blue (40% метанол, 10% оцетна киселина, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), обезцветява се и се излага на фосфоресцентен образен екран за 20 часа (за откриване на nsp12 от NMPylation) или (максимум) 2 часа (за оценка на nsp9 NMPylation).Устройство за изображения Typhoon 9200 (GE Healthcare) беше използвано за сканиране на екрана и ImageJ беше използван за анализиране на интензитета на сигнала.
За MS анализ, 1 µM nsp12-His6 и 10 µM nsp9 (без хексахистидинов маркер) бяха използвани в анализа на NMPилиране (SI приложение, Таблица S1) и беше използвана повишената концентрация на 500 µM UTP и GTP.В зависимост от тяхната концентрация и очакваното качество на протеина, система Waters ACQUITY H-Class HPLC, оборудвана с колона MassPrep (Waters), беше използвана за обезсоляване на 1 до 10 µL буферирани протеинови разтвори онлайн.Обезсоленият протеин се елуира в източника на електроспрей йони на Synapt G2Si масспектрометър (Waters) през следния градиент на буфер А (вода/0,05% мравчена киселина) и буфер В (ацетонитрил/0,045% мравчена киселина), а температурата на колоната е 60 °C и скорост на потока 0,1 mL/min: елуиране изократно с 5% А за 2 минути, след това линеен градиент до 95% В в рамките на 8 минути и поддържане на 95% В за още 4 минути.
Откриват се положителни йони с масов диапазон от 500 до 5000 m/z.Glu-фибринопептид B се измерва на всеки 45 секунди за автоматична корекция на дрейфа на масата.Използвайте инструментален софтуер MassLynx с разширение MaxEnt1, за да деконволвирате средния спектър след приспадане на базовата линия и изглаждане.
UMPилиран HCoV-229E nsp9 се усвоява чрез добавяне на модифициран трипсин с степен на секвениране (Serva) и се инкубира за една нощ при 37 °C.За обезсоляване и концентриране на пептидите се използва центрофугираща колона Chromabond C18WP (номер на част 730522; Macherey-Nagel).Накрая, пептидът се разтваря в 25 µL вода, която съдържа 5% ацетонитрил и 0.1% мравчена киселина.
Пробите бяха анализирани чрез MS с помощта на масспектрометър Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).Най-добрата nanoâ HPLC система (Dionex), оборудвана с персонализиран крайно монтиран 50 cm??75 μm C18 RP колона, пълна с 2,4 μm магнитни перли (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Свържете се към масспектрометъра онлайн чрез източника на наноспрей Proxeon;инжектирайте 6 µL разтвор за смилане на трипсин във вътрешен диаметър 300 µm ×??1 cm C18 PepMap колона за предварителна концентрация (Thermo Scientific).Като се използва вода/0,05% мравчена киселина като разтворител, пробата автоматично се улавя и обезсолява при скорост на потока от 6 µL/min.
Следните градиенти на вода/0,05% мравчена киселина (разтворител А) и 80% ацетонитрил/0,045% мравчена киселина (разтворител В) бяха използвани за постигане на разделяне на триптичните пептиди при скорост на потока 300 nL/min: 4% B за 5 минути, след това 30 A линеен градиент до 45% B в рамките на минути и линейно увеличение до 95% разтворител B в рамките на 5 минути.Свържете хроматографската колона към наноизлъчвател от неръждаема стомана (Proxeon) и напръскайте елуента директно към нагрятата капилярка на масспектрометъра, като използвате потенциал от 2300 V. Проучвателното сканиране с разделителна способност 60 000 в масовия анализатор Orbitrap е свързано с най-малко три MS/MS сканирания на данни, динамично изключени за 30 секунди, като се използва дисоциация, предизвикана от сблъсък на йонен капан, или дисоциация от сблъсък с по-висока енергия, комбинирана с откриване на орбитална трапеция, Разделителната способност е 7500.
Време на публикуване: 3 август 2021 г